* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 超临界流体萃取是利用萃取剂密度的变化而导致其对待分离组分的溶解能力的变化，从而实现分离的过程。因此，超临界流体萃取过程分萃取和分离两个阶段。在萃取阶段，因超临界流体有最大的密度，对待分离组分有最大的溶解度，出而能将所需组分从物料中萃取比来。在分离阶段，超临界流体的密度变化到最小，对其中已萃取出来的组分溶解度也最小，使之析出而实现分离。萃取剂可返回过程循环使用。 * * 此种流程中，由于温度升高会使溶质的蒸气压也提高，其溶解度也会提高。往往会抵消了升温导致超临界流体的分离效果，因而比较复杂一些。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * (2)等压变温法 等压变温法流程中，超临界流体的压力保持一定，而利用温度的变化，引起超临界流体对溶质溶解度的变化，从而实现溶质与超临界流体分离的过程，降温升压后的萃取剂，处于超临界状态，被送入到萃取槽中与物料接触进行萃取。然后，萃取了溶质的超临界流体经加热器升温后在分离槽析出溶质。作为萃取剂的气体经冷却器等降温升压后送回萃取槽循环使用。 1 3 P1 2 4 T1T2 P1=P2 1—萃取槽； 2—加热器； 3—分离槽； 4—泵；5—冷却器 P2 T2 T1 5 溶质 (3)吸附法 此种流程是将萃取了溶质的超临界流体，再通过—种吸附分离器，这种吸附分离器中装有只吸附溶质而不吸附萃取剂的吸附剂，当萃取了溶质的超临界流体通过这种吸附分离器后，溶质便与萃取剂即超临界流体分离，萃取剂经压缩后循环使用。 1 3 P1 2 4 T1=T2 P1=P2 1—萃取槽； 2—吸附剂； 3—分离槽； 4—泵； P2 T2 T1 问题：这三种流程哪一种应用最广泛？ 吸附法：理论上不需要压缩能耗和热交换能耗，是最省的过程，但该法只适于与可使用选择性吸附方法分离目标组分的体系，绝大多数天然产物很难通过吸附剂来收集产品，故该法只用于少量杂质脱除过程。 等压变温法：温度变化对CO2流体的溶解度影响远小于压力变化的影响，虽可节省能耗，但实际分离性能受到很多限制。 故通常超临界CO2萃取过程大多采用改变压力的等温流程。 咖啡因超临界萃取流程 大型超临界流体萃取装置 实验室超临界流体萃取装置 双水相萃取 有机溶剂萃取的不足： 许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂 ； 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。 1、双水相的形成 （1）天然的或合成的水溶性的聚合物溶液，当他们与第二种水溶性聚合物相混时，只要聚合物浓度高于一定值，就可能产生相分离，形成双水相。原因：聚合物之间的不相容性，即聚合物分子的空间阻碍作用使相互无法渗透，而分为两相 （2）加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也能形成两相。 常用聚合物： 聚乙二醇－葡聚糖 聚乙二醇－无机盐系统 无毒原则 2、影响物质分配平衡的因素 （1）聚合物及其分子量的影响 不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性按下列次序递增: 葡聚糖硫酸盐 甲基葡聚糖 葡聚糖 羟丙基葡聚糖 甲基纤维素 聚乙烯醇 聚乙二醇 聚丙三醇 同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的和方向，在PEG/DEX系统中，蛋白质的分配系数随着DEX相对分子量的增加而增加。若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于PEG聚合物，应降低它的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白质收率，则PEG的平均分子量应增加。 （2） pH 值的影响 改变两相的电位差 如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大，则蛋白质在两相中分配越不均匀。 pH 值的变化也会导致组成体系的物质电性发生变化，也会使被分离物质的电荷发生改变，从而影响分配的进行。 （3）离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响 在双水相聚合物系统中，加入电解质时，其阴阳离子在两相间会有不同的分配。同时，由于电中性的约束, 存在一穿过相界面的电势差(Donnan 电势) ,它是影响荷电大分子如蛋白质和核酸等分配的主要因素。同样，对于粒子迁移也有相似的影响，粒子因迁移而在界面上积累。故只要设法改变界面电势，就能控制蛋白质等电荷大分子转入某一相。 （4）温度的影响 分配系数对温度的变化不敏感 成相聚合物对蛋白质有稳定化作用,所以室温操作活性收率依然很高,而且室温时粘度较冷却时(4 ℃) 低,有助于相的分离并节省了能源开支。 3、双水相萃取技术的特点 (1) 系统含水量多达75 %～90 % ,两相界面张力极低(10 - 7～10 – 4 N·m - 1) ,有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递 (2) 分相时间短(特别是聚合物/ 盐系统) ,自然分相时间一般只有5～15min。 (3) 双水相分配技术易于连续化操作。 (4) 目标产物的分配系数一般大于3 ,大多数情况下,目标产物有较高的收率。 (5) 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液分离方法相比,双水相分配技术可省去1～2 个分离步骤,使整个分离过程更经济。 (6) 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。 双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产物的萃取; PEG的循环; 无机盐的循环。 （1）目的产物的萃取：原料匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进入分离器分相。一般目标蛋白分配到上相（PEG相），细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白分配到下相。 4、双水相萃取的工艺流程 （2）PEG的循环：成相材料的回收和循环使用，可减少废水的处理费用，还可以节约化学试剂，降低成本。 PEG的回收方法： 加入盐使目标物转入盐相 离子交换洗涤 （3）无机盐的循环：将无机盐相冷却，结晶，然后用离心机分离收集。 目前已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。 （1）双水相萃取法常用于胞内酶提取。 5、双水相萃取的应用 （2）双水相萃取分离蛋白质 要成功地运用两水相萃取的方法，应满足下列条件： 欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中； 酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到高的收率； 两相用离心机很容易分离。 反胶束萃取技术（Reversed micellar extraction）是近年来发展起来的一种新型萃取分离技术，主要适合于蛋白质的提取和分离。 是利用表面活性剂在有机溶剂中自发形成一种纳米级的反胶束相来萃取水溶液中的大分子蛋白质。 反胶束法 料液 有机相 静电引力：主要是蛋白质的表面电荷与反胶束内表面电荷（离子型表面活性剂）之间的静电引力作用。 空间位阻作用：增大反胶束极性核的尺寸，以减小大分子蛋白进入胶核的传质阻力。 凡是能够引起静电引力，能够促使反胶束尺寸增大的因素均有利于提高分配系数。 这些因素主要是pH、离子强度、表面活性剂种类和浓度等，通过因素优化，实现选择性地萃取和反萃取。 反胶束萃取的原理： 在反胶束内部包含了水溶液，蛋白质等生物分子萃取后进入反胶团内部的“水池” 中，避免了与有机溶剂直接接触，反胶束内的微环境与生物膜内相似，故能很好保持其生物活性，解决了蛋白质在有机溶剂中容易变性失活和难溶于有机溶剂的问题，为蛋白质的提取和分离开辟了一条新的途径。 成本低，有机溶剂可反复使用；容易放大和实现连续操作 反胶束萃取是一条具有工业发展前景的蛋白质分离技术。 反胶束法的优点 课堂讨论题1： 螺旋霉素（SPM）为一弱碱性抗生素，分子结构中有两个二甲胺基，pK1=7.1、pK2=8.4，文献报导，螺旋霉素游离碱易溶于氯仿、醇类、酮类、酯类、己烷和苯等。螺旋霉素的盐类极性较大，能溶于水和低级醇。在pH2.0和pH9.5溶液中不稳定，特别在酸性条件下稳定性更差。 1. 为什么萃取时适宜的pH=9.0左右 ? 不能过大的理由。 2. 萃取时温度为什么应升至35℃左右？ 3. 反萃取主要为了除去哪类杂质? 4. 适宜的反萃取pH应满足哪些条件?过高或过低有何不利? 5. 若萃取液中混有一碱性杂质，极性较弱（pK杂pKSPM），如何除去？ 6. 若萃取液中混有一碱性杂质，极性较强（pK杂pKSPM），如何除去？ 解答： 1. 为什么萃取时适宜的pH=9.0左右 ? 碱性物质：随着pH↑，K↑， 应满足pH8.4，SPM 游离分子含量增加 在弱极性的有机溶剂中溶解度增大。 不能过大的理由？ ① pH超过9.0以后，K增加不明显； ② SPM 稳定性下降； ③ 极性比SPM更强的杂质（如pK杂≥ 9），容易被萃取到有机 相中，造成纯度降低。 2. 萃取时温度为什么应升至35℃左右？ 螺旋霉素在水中的溶解度随温度升高而减小，低温时溶解度较大。因此，萃取时应适当提高温度，有利于螺旋霉素进入有机相。 温度对萃取分配系数的影响 温度过高，容易破坏，因此适宜的萃取温度为35℃左右。 3. 反萃取主要为了除去哪类杂质? 极性比螺旋霉素弱的碱性杂质（pK杂pKSPM），使留在有机相，达到进一步提纯目的。 4. 适宜的反萃取pH应满足哪些条件?过高或过低有何不利? ① 满足pH7.1（SPM+1和SPM+2含量增大 ）→水相溶解度↑ ∴ 应使溶液pH↓（ pH↓，K反↑）； ② 在SPM稳定范围，酸性水溶液易降解， ∴ pH过低，K反值反而减小； ③ 使弱碱性杂质除去，提高产品纯度 ∴ pH不能过低（ pK杂pHpKSPM ）。 pH对反萃取分配系数的影响 5.若萃取液中混有一碱性杂质，极性较弱（pK杂pKSPM） 如何除去？ 反萃取时除去：适当提高反萃液的pH（ pK杂pHpKSPM） 用适当pH的缓冲液洗涤萃取液，要求杂质较多进入缓冲液，而SPM尽可能少被洗下来。 ∴ 缓冲液pH应满足：pK杂pHpKSPM （使杂质解离度大，而SPM解离度小）。 6. 若萃取液中混有一碱性杂质，极性较强（pK杂pKSPM） 如何除去？ 课堂讨论题2： 林可霉素性质：碱性抗生素，分子中有一个胺基pK=7.6；pH2.0的溶液中不稳定；盐酸盐易溶于水，游离碱在水中溶解度较小，易溶于有机溶剂，如醇类（甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇）；酯类（乙酯，丁酯）；酮类（丙酮、甲乙酮）等，醇类中溶解性比酯和酮类中好。 设计提取工艺路线： 能否用萃取法提取？ 选用什么溶剂最好？理由？ 萃取时pH范围？ 欲提高分配系数，可采取什么措施？ 如需进一步反萃取，考虑反萃取的pH范围。原因？ 1. a. 萃取法适用于弱酸弱碱性物质 Lin — pK=7.6 弱碱性物质, 不同形态时溶解度不同。 b. 选丁醇，原因： ① 醇类中溶解度最大 ② 丁醇C链长，与水互溶度小。 c. pH7.6， Lin 游离分子浓度↑ 当pH10.0时, C0 = 99.6% C+ = 0.4% ∴ 选pH10 pH再升高是否更好? ① Lin 几乎都呈游离分子, 溶解度不会再增大; 且耗碱量多 ② 被同时萃取的碱性杂质↑, 分离效率↓ ③ Lin 稳定性受影响 d. 加NaCl, 盐析作用: ① 水中溶解度进一步↓ K↑(18→28) ②两相互溶度↓易分层。 e. 反萃pH: 2.0 pH7.6 原因: pH7.6: Lin电离度大“+” 易溶于水 pH 2.0: Lin 稳定性。 思考题 1.何谓超临界流体萃取？其特点有哪些？ 2.何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪些？ 3.反胶团的基本结构？反胶团萃取的特点有哪些？ * 3. 盐析： 无机盐——氯化钠、硫酸铵，作用： 生化物质在水中溶解度↓；两相比重差↑ 两相互溶度↓ 例：pen从水相→丁酯中，加氯化钠洗涤， 消除有机相水滴，提高质量和收率； 2．有机溶剂的选择 根据相似相溶的原理，选择与目标产物极性相近的有机溶剂为萃取剂，可以得到较大的分配系数（根据介电常数判断极性）； 有机溶剂与水不互溶，与水有较大的密度差，黏度小，表面张力适中，相分散和相分离容易； 应当价廉易得，容易回收，毒性低，腐蚀性小，不与目标产物反应。 常用于生化萃取的有机溶剂有丁醇、丁酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯等。 3．带溶剂 对于水溶性强的溶质，可利用脂溶性萃取剂与溶质间的化学反应生成脂溶性复合分子，使溶质向有机相转移。 ①抗生素萃取剂：月桂酸、脂肪碱或胺类等。 ②氨基酸萃取剂：氯化三辛基甲铵。 溶质与带溶剂之间的作用：离子对萃取、离子交换萃取、反应萃取。 4．乳 化 乳化：水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或水相中的现象。 这样形成的分散体系称乳浊液。 乳化带来的问题：有机相和水相分相困难，出现夹带，收率低，纯度低。 乳化 固体粉末乳化剂：除表面活性剂外，能同时为两种液体所润湿的固体粉末也能作为乳化剂，如粉末对水的润湿性强于对油的润湿性，则根据自由能最小的原则，形成水包油O/W型乳浊液。反之形成油包水型 乳化 发酵液乳化的原因： a 蛋白质的存在，起到表面活性剂 b 固体粉末对界面的稳定作用 2）乳浊液的稳定条件 乳浊液稳定性和下列几个因素有关： ①界面上保护膜是否形成； ②液滴是否带电； ③介质的粘度。 表面活性剂分子在分散相液滴周围形成保护膜。保护膜具有一定的机械强度，不易破裂，能防止液滴碰撞而引起聚沉。 介质粘度较大时能增强保护膜的机械强度。 （亲憎平衡值） 表面活性剂的亲水与亲油程度的相对强弱，在工业上常用HLB数来表示。 即亲水与亲油平衡程度，HLB数越大，亲水性越强，形成O/W型乳浊液，HLB数越小，亲油性越强，形成W/O型乳浊液。 HLB数 应用 3—6 W/O乳浊液 7—9 润湿剂 8—15 O/W乳浊液 13—15 洗涤剂 15—18 助溶剂 表18-3 各种表面活性剂的用途 物理法：离心、加热，吸附，稀释 化学法：加电解质、其他表面活性剂 * 转型法 加入一种乳化剂，条件： ① 形成的乳浊液类型与原来的相反，使原乳浊液转型 ② 在转型的过程中，乳浊液破坏，控制条件不允许形成相反的乳浊液， * 顶替法 加入一种乳化剂，将原先的乳化剂从界面顶替出来： ① 形成的乳浊液类型与原来的一致 ② 它本身的表面活性 原来的表面活性 ③ 不能形成坚固的保护膜。 3）．乳浊液的破坏措施 萃取方式 ※ 萃取过程：1）混和 2） 分离 3）溶剂回收 ※ 操作方式 单级萃取 多级萃取 多级错流 多级逆流 ※ 理论收率计算 假定：两相中的分配很快达到平衡； 两相完全不互溶，完全分离： ★ 萃取因素： 1. 单级萃取 单级萃取流程示意图 单级萃取：只包括一个混合器和一个分离器 2）多级错流萃取 料液经萃取后，萃余液再与新鲜萃取剂接触，再进行萃取。 第一级的萃余液进入第二级作为料液，并加入新鲜萃取剂进行萃取；第二级的萃余液再作为第三级的料液，以此类推。 此法特点在于每级中都加溶剂，故溶剂消耗量大，而得到的萃取剂平均浓度较稀，但萃取较完全。 多级错流萃取示意图 料液入口 第一级 第二级 第三级 萃余液出口 3）多级逆流萃取 在多级逆流萃取中，在第一级中连续加入料液，并逐渐向下一级移动，而在最后一级中连续加入萃取剂，并逐渐向前一级移动。 料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反，故称为逆流萃取。 在逆流萃取中，只在最后一级中加入萃取剂，故和错流萃取相比，萃取剂之消耗量较少，因而萃取液平均浓度较高。 多级逆流萃取图 青霉素的多级逆流萃取 青霉素发酵过滤液进入第一级萃取罐，在此与从第二级分离器来的萃取相（含产品青霉素）混合萃取，然后流入第一级分离器分成上下层， 上层为萃取相，富含目的产物，送去蒸馏回收溶剂和产物进一步精制； 下一层为萃余相，含目的产物浓度比新鲜料液低得多，送第二级萃取； 如此经三级萃取后，最后一级的萃余相作为废液排走。 上面讨论的萃取属于物理萃取，是指用一个有机溶剂择优溶解目标溶质，符合分配定律。 在物理萃取的应用中一个主要的限制是需要发现一个在有机相和水相之间对目标溶质分配系数足够高的溶剂 除此以外，用有机溶剂萃取弱电解质（有机酸或有机碱）时都要调节溶液的pH使其小于pKa（对有机酸）或大于pKa（对有机碱），这样会影响目标溶质的稳定性，因此启发人们寻找新的萃取体系。 离子对/反应萃取就是使目标溶质与溶剂通过络合反应，酸碱反应或离子交换反应生成可溶性的复合络合物，易从水相转移到有机溶剂/萃取系统中。 主要有两类萃取剂： 1.有机磷类萃取剂 2.胺类萃取剂 磷酸三丁酯（TBP） 氧化三辛基膦（TOPO） 二?2?乙基己基磷酸（DEHPA） 有机磷类萃取剂与目标溶质发生络合反应，而易于转移到萃取相，在类似的条件下，用有机磷类化合物萃取弱有机酸比醋酸丁酯等碳氧类萃取剂分配比要高很多。 胺类萃取剂(三辛胺) 可与目标溶质发生反应，用胺类长链脂肪酸从水溶液中萃取带质子的有机化合物是一个可行的过程，并用于从发酵液中大规模回收柠檬酸。 离子对/反应萃取-稀释剂 此类萃取剂都要溶解在稀释剂中， 稀释剂：溶解萃取剂，改善萃取相的物理性质的有机溶剂，如煤油、己烷、辛烷、苯。稀释剂的选择： ①分配系数：稀释剂能够影响分配系数，特别是通过萃取剂/溶剂复合物的溶剂化作用。 ②选择性：为萃取尽可能少的杂质，使用非极性稀释剂更好。 ③水溶性：低的水溶性，使溶剂的损失最少。 ④毒性：对食品和药品应低毒或无毒的溶剂，长链烷烃由于它们具有低毒和低水溶性，因此理应优先使用。 ⑤粘度和密度：低粘度和低密度的稀释剂会使分相更容易。 ⑥稳定性：烷烃比醇、酯和卤代烃更难降解 ⑦第三相的形成： 离子对/反应萃取的应用 青霉素-TBP(磷酸三丁酯)萃取 虽然离子对/反应萃取体系对生物产物的萃取具有选择性高、溶剂损耗小、产物稳定等优点，但是由于溶剂的毒性会引起产品残留毒性影响健康，只有那些可用于工业原料的产物，才有使用价值，故有待进一步研究开发。 思考题： 1 理解概念：分配系数，分离因素，离子对/反应萃取 2 pH 对弱电解质的萃取效率有何影响？ 3 发酵液乳化现象产生原因与影响？如何消除乳化现象？ 4 萃取方式包括哪些？ 近20年来研究溶剂萃取技术与其他技术相结合从而产生了一系列新的分离技术，如： 超临界萃取（Supercritical Fluid Extraction） 逆胶束萃取（Reversed Micelle Extraction） 液膜萃取（Liquid Membrane Extraction） 微波辅助萃助（microwave-assisted extraction) 两水相萃取（aqueous two-phase system) 溶剂萃取法新技术 一 超临界流体萃取 概念：利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下，与待分离的物料(液体或固体)接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方法，使萃取物得到分离。 所谓超临界流体(SCF)即处于临界温度、临界压力以上的流体。 在临界温度、压力以上，无论压力多高，流体都不能液化但流体的密度随压力增高而增加。 特点：密度接近液体 萃取能力强 粘度接近气体 传质性能好 超临界流体萃取 超临界二氧化碳萃取 常用萃取剂 极性萃取剂：乙醇、甲醇、水（难） 非极性萃取剂：二氧化碳（易） 超临界二氧化碳临界点：Tc=31.26℃、Pc=7.2MPa 优点： 缺点： 临界条件温和 设备投资大 产品分离简单 无毒、无害 不燃 无腐蚀性 价格便宜 超临界流体的应用 超临界流体(supercritical fluid, SCF)对脂肪酸、植物碱、醚类、酮类、甘油脂等具有特殊的溶解作用，因此可用于这类物质的萃取分离。 咖啡因萃取 植物油：胚芽油、玉米油、γ-亚麻酸 天然香料：杏仁油、柠檬油 尼古丁 超临界流体萃取的典型流程 根据对过程中超临界流体密度调控的方法不同，超临界流体萃取的流程可分为 等温变压法 等压变温法 吸附法 （1）等温变压法 此种流程通过压力的变化引起超临界流体密度的变化，使得组分从超临界流体中析出分离。萃取剂经压缩达到最大溶解能力的状态点(即超临界状态)后加入到萃取器中与物料接触进行萃取。当萃取了溶质的超临界流体通过膨胀阀进入分离槽后，压力下降，超临界流体的密度也下降，对其中溶质的溶解度跟着下降。溶质于是析出并在槽底部收集取出。 1 3 P1 2 4 T1=T

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