本发明涉及物质的萃取与纯化的技术领域，尤指一种红曲发酵产品的二次代谢产物的纯化萃取方法。

　　NTU 568红曲菌株(Monascus mutant,Monascus purpureus NTU 568)，由中国台湾某大学微生物与生化学研究所潘子明教授及其研发团队所研发的一个优良的台湾本土红曲菌株。此NTU 568红曲菌具有快速增长、淀粉水解能力强、以及二次代谢(metabolites production)能力强的特点。此外，NTU 568红曲菌的最佳培养基必须含有2％的米粉(rice powder)，并且其最佳培养温度为30℃、最佳培养时间为48小时、最佳培养压力为1个大气压。

　　为了证实此NTU 568红曲菌的生存能力(viability)，可将NTU 568红曲菌自斜管(slant tube)中转移自一马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)的上进行15天的培养；接着，自PDA上挖3块1cm3的菌丝体，并将菌丝体置入含有2％米粉(rice powder)的一培养液上，经48小时之后发现培养液呈现红色，这显示了NTU 568红曲菌具有相当的生存能力。另外，必须补充说明的是，NTU 568红曲菌的储存方式为于4℃的环境中存放于具有PDA培养基的斜管内，且必须每3个月次培养(sub-cultured)一次。

　　近年来保健食品蓬勃发展，具有多功效的机能性发酵制品红曲逐渐受到重视。在亚洲地区，红曲菌(Monascus species)于饮食、医药上的应用，已有千年的历史。其中，红曲菌重要的二级代谢产物包含下列四种：

　　早期，为了确认红曲素(Monascin)与红曲黄素(Ankaflavin)的化学结构，研究人员利用薄层层析分离方法(Thin layer chromatography)自红曲菌丝体中分离出红曲素与红曲黄素。其中，早期的薄层层析分离方法包括以下步骤:

　　步骤(S05a):备好正己烷及纤维素层析管柱，进而透过层析法(chromatography)对该过滤物进行纯化；

　　步骤(S06a):备好20厘米见方的硅胶制薄层层析板(TLC,Thin Layer Chromatography)以及展开液(含25％的苯)，进而分离前述步骤(S05a)所获得的黄色分层之中的红曲素与红曲黄素，并刮下红曲黄素分层；

　　步骤(S08a):干燥前述步骤(S07a)的萃取物之后以乙醇将其结晶，进而获得一黄色棱晶(yellow prism)；其中，每一克黄色棱晶之中含有74毫克的红曲黄素。

　　众所周知的，薄层层析分离方法(Thin layer chromatography)主要应用于微量纯物质的分离纯化，并无法被应用于大量纯物质的分离纯化。以薄层层析分离方法为例，必须同时使用20至100片的硅胶制薄层层析板才能够自黄色分层之中分离出1克的红曲黄素。

　　步骤(S01b):以12公升的酒精(70％)萃取1.5公斤的红曲米30分钟；

　　步骤(S02b):过滤前述步骤(S01b)的产物，并以3公升的酒精(70％)清洗过滤物；

　　步骤(S03b):于50℃下将前述步骤(S02b)的滤液与清洗液进行(真空)减压浓缩；

　　步骤(S04b):将前述步骤(S03b)的产物内的酒精去除，进而获得152.9克的第一粗萃取物；

　　步骤(S05b):将该粗萃取物置于1公升水中，然后以0.5公升的乙酸乙酯进行五次的液液萃取；

　　步骤(S06b):于50℃下将前述步骤(S05b)所得的乙酸乙酯萃取液进行(真空)减压浓缩；

　　步骤(S07b):将前述步骤(S06b)的产物内的乙酸乙酯去除，进而获得26.1克的第二粗萃取物；

　　步骤(S08b):备好硅胶层析管柱及冲提溶剂，进而透过层析法(chromatography)对11.9克的第二粗萃取物进行纯化；其中，所述冲提溶剂为11种，分别为正己烷/乙酸乙酯＝1/0、正己烷/乙酸乙酯＝9:1、正己烷/乙酸乙酯＝4:1、正己烷/乙酸乙酯＝1:1、正己烷/乙酸乙酯＝3:7、正己烷/乙酸乙酯＝1:9、正己烷/乙酸乙酯＝0/1、乙酸乙酯/甲醇＝9:1、乙酸乙酯/甲醇＝1:1、乙酸乙酯/甲醇＝0/1(v/v,体积比)；

　　步骤(S09b):自前述步骤(S08b)所获得的11个分层(A～K)之中取出250亳克的C分层；

　　熟悉纯物质萃取技术的工程人员可以通过实务操作发现，文献一的纯化萃取方法无法应用于自发酵红曲米(Red Mold Rice)的中萃取出大量的红曲黄色素，理由如下:由于文献一的纯化萃取方法最终所得到的红曲黄色素为18亳克(14亳克monascin与4亳克ankaflavin)，故吾人可以推知250亳克的C分层的中仅仅含有7.2％(18/250)的黄色素；亦即，文献一的纯化萃取方法的步骤(S01b)～步骤(S09b)所使用的技术，应该不是最适于分离黄色分层的技术。

　　有鉴于文献一的纯化萃取方法无法高效率地地自发酵红曲米之中萃取出monascin与nkaflavin，一种高效液相层析法(Liquid Chromatograph)于文献二之 中被提出。于此，文献二指的是中国专利第CN101255168B号。文献二所记载的高效液相层析法，包括以下步骤:

　　步骤(S01c):以正己烷作为提取液萃取10克的红曲米粉末，直至提取液无色；

　　步骤(S05c):过滤前述步骤(S04c)所得的甲醇溶液，得到一样品溶液；

　　虽然文献二指出其高效液相层析法能够制得纯度96.761％的红曲素纯品(Monascin)以及纯度99.234％安卡红曲黄素纯品(Akaflavin)；然而，熟悉纯物质萃取技术的工程人员可以通过实务操作发现，文献二的高效液相层析法仍显示出以下缺点：

　　由于每次的HPLC必须历时80分钟才能分离1毫升的样品溶液，故50毫升的样品溶液必须进行50次的HPLC(共历时4000分钟)才能够完成；并且，由于10克的红曲米粉经过所述高速逆流层析工艺之后仅能够得到30毫克的红曲素，因此可推知每次80分钟的HPLC只能够得到0.6毫克的红曲素。

　　有鉴于文献二的纯化萃取方法无法快速地自发酵红曲米的中萃取出红曲素与红曲黄素，一种高速逆流层析法(High Speed Counter Current Chromatograph,HSCCC)于文献三之中被提出。于此，文献三指的是中国专利第CN101864191 B号。文献三所记载的高速逆流层析法，包括以下步骤:

　　步骤(S01d):于60℃的水浴下，使用甲醇溶液萃取粉状红曲米；其中，粉状红曲米与甲醇溶液的固液比为1:15；

　　步骤(S02d):将前述步骤(S01d)所获得的产物线，进而获得一粗萃物；

　　步骤(S04d):备好高速逆流层析系统及冲提溶剂(即，流动相)，进而通过高速逆流层析(HSCCC)对前述步骤(S03d)所获得的产物进行纯化；其中，所述冲 提溶剂石油醚/乙酸乙酯/乙醇/水＝2.5:7.5:5:5(v：v：v:v)；

　　步骤(S05d):于60℃之下将该高速逆流层析系统所收集到的分离液真空浓缩至干，然后收集黄色色素纯化组分，并接着以85％丙酮溶液溶解该黄色色素纯化组分；

　　步骤(S06d):于60℃之下将前述步骤(S07d)的产物真空浓缩至过饱和，然后缓慢降温至15℃，接着便获得红曲素与红曲黄素晶体。

　　然而，熟悉纯物质萃取技术的工程人员可以通过实务操作发现，文献三的HSCCC仍显示出以下缺点：

　　(1)HSCCC需同时使用多种溶剂单次处理800mg红曲萃取物；其中，800mg红曲萃取物由大约12克的红曲米之中萃取而得。

　　(2)此外，虽然目前制备型的HSCCC设备的容量可达4800mL且每次处理样品溶液的量为200mL(＝50mLx4)，使用制备型的HSCCC设备对48克(＝12克x4)的红曲米粉进行萃取仍旧需要历时133分钟。另外一点必须考虑的是，制备型的HSCCC设备的价格非常昂贵，其售价约台币1400万元。

　　因此，有鉴于现有的纯物质的萃取方法、液相层析法与高速逆流层析法皆于实务应用上显现诸多缺陷，继续开发一种新颖纯物质萃取方法，适于自红曲发酵产品之中萃取出至少一种二次代谢产物。

　　本发明的主要目的，在于提供一种纯物质萃取方法，使其萃取红曲素及红曲黄素时具备萃取速度快以及减少使用有机溶剂的优点。

　　为了达成上述目的，本发明提出一种纯物质萃取方法，适于自红曲发酵产品中萃取出至少一种二次代谢产物，该方法包括以下步骤：

　　(1)备好一特定重量的一红曲发酵产品，并以一第一体积的一提取液于一第一温度下对该红曲发酵产品进行萃取，历时一第一萃取时间；

　　(2)收集前述步骤(1)的一第一萃取液并过滤，进而得到一第一过滤萃取液以及经过一次萃取的该红曲发酵产品；

　　(3)以一第二体积的该提取液于该第一温度下对经过一次萃取的该红曲发酵产品进行再次萃取，历时一第二萃取时间；

　　(4)收集前述步骤(3)的一第二萃取液，并过滤，进而得到一第二过滤萃取液； 以及

　　(5)收集该第一过滤萃取液与该第二过滤萃取液，进而将其处理成为一纯物质。

　　(51)混合该第一过滤萃取液与该第二过滤萃取液以得到一混合萃取液，并将该混合萃取液浓缩至浓稠状；

　　(54)接着加入一第四体积的水于该样品溶液中，再搅拌该样品溶液历时一第二搅拌时间；

　　(55)以转速2000rpm/min对前述步骤(54)所得的该样品溶液进行离心步骤，历时一第一离心时间；以及

　　于上述的纯物质萃取方法中，较佳地，所述红曲发酵产品可为下任一者：红曲米或红曲山药。

　　于上述的纯物质萃取方法中，较佳地，红曲发酵产品的该特定重量至少为60克，且所述红曲发酵产品可为下任一者：红曲米或红曲山药。

　　于上述的纯物质萃取方法中，较佳地，该第一体积与该第二体积介于250毫升至320毫升之间，且该第四体积为8～12毫升。

　　于上述的纯物质萃取方法中，较佳地，该第一温度介于50℃至65℃之间，且该第二温度介于55℃至75℃之间。

　　于上述的纯物质萃取方法中，较佳地，该第一萃取时间为1～3小时，且该第二萃取时间为1～3小时。

　　于上述的纯物质萃取方法中，较佳地，该溶剂为浓度95％的乙醇，且该溶剂的该第三体积为8～12毫升。

　　于上述的纯物质萃取方法中，较佳地，该第一搅拌时间为3～7分钟，且该第二搅拌时间为3～7分钟。

　　于上述的纯物质萃取方法中，较佳地，每一克的该沉淀物含有至少22.5毫 克的红曲素(Monascin)以及至少16.83毫克的红曲黄素(Ankaflavin)。

　　于上述的纯物质萃取方法中，较佳地，该沉淀物占该样品溶液的一重量百分比至少为25％。

　　于上述的纯物质萃取方法中，较佳地，所述红曲素(Monascin)的萃取回收率至少为97.35％，且所述红曲黄素(Ankaflavin)的萃取回收率至少为95.16％。

　　并且，为了上述目的，本发明还提出另一种纯物质萃取方法，适于自红曲发酵产品中萃取出至少一种二次代谢产物，包括以下步骤：

　　(1’)备好一特定重量的一红曲发酵产品，并以一第一体积的一提取液于一第一温度下对该红曲发酵产品进行萃取，历时一第一萃取时间；

　　(2’)收集前述步骤(1’)的一第一萃取液，并过滤，进而得到一第一过滤萃取液以及经过一次萃取的该红曲发酵产品；

　　(3’)以一第二体积的该提取液于该第一温度下对经过一次萃取的该红曲发酵产品进行再次萃取，历时一第二萃取时间；

　　(4’)收集前述步骤(3’)的一第二萃取液，并过滤，进而得到一第二过滤萃取液；以及

　　(5’)收集该第一过滤萃取液与该第二过滤萃取液，进而将其处理成为一纯物质。

　　(52’)将该混合萃取液浓缩至一第三体积，然后将一第四体积的水加入于该混合萃取液中，以获得一第一样品溶液；

　　(53’)以转速2000rpm/min对前述步骤(52’)所得的该第一样品溶液进行离心步骤，历时一第一离心时间；

　　(55’)将该第一沉淀物溶于一第五体积的一溶剂中，以获得一第二样品溶液；

　　(57’)接着将一第六体积的水加入该第二样品溶液中，再搅拌该第二样品溶液历时一第二搅拌时间；

　　(58’)以转速2000rpm/min对前述步骤(57’)所得的该第二样品溶液进行离心步骤，历时一第二离心时间

　　于上述的纯物质萃取方法的另一实施例中，较佳地，所述红曲发酵产品的该特定重量至少为20公斤，且所述红曲发酵产品可为下任一者：红曲米或红曲山药。

　　于上述的纯物质萃取方法的另一实施例中，较佳地，该提取液为浓度95％的乙醇，且该第一体积与该第二体积至少为60公升。

　　于上述的纯物质萃取方法的另一实施例中，较佳地，该第一温度介于50℃至65℃之间，且该该第二温度介于55℃至75℃之间。

　　于上述的纯物质萃取方法的另一实施例中，较佳地，该第一萃取时间为1～3小时，且该第二萃取时间为1～3小时。

　　于上述的纯物质萃取方法的另一实施例中，较佳地，该第三体积至少为4公升，该第四体积至少为4公升，该第五体积为1～2公升，且该第六体积为1.5～2.5公升。

　　于上述的纯物质萃取方法的另一实施例中，较佳地，该第一离心时间为8～12分钟，且该第二离心时间为8～12分钟。

　　于上述的纯物质萃取方法的另一实施例中，较佳地，该溶剂为浓度95％的乙醇。

　　于上述的纯物质萃取方法的另一实施例中，较佳地，该第一搅拌时间为10～20分钟，且该第二搅拌时间为3～7分钟。

　　于上述的纯物质萃取方法的另一实施例中，较佳地，每一克的该第二沉淀物含有至少22.5毫克的红曲素(Monascin)以及至少16.83毫克的红曲黄素(Ankaflavin)。

　　于上述的纯物质萃取方法的另一实施例中，较佳地，该第二沉淀物占该第二样品溶液的一重量百分比至少为25％。

　　于上述的纯物质萃取方法的另一实施例中，较佳地，所述红曲素(Monascin)的萃取回收率至少为98％，且所述红曲黄素(Ankaflavin)的萃取回收率至少为98％。

　　本发明提供不同于现有的纯物质萃取方法的一种新颖纯物质萃取方法。取代现有的有机萃取液以及管柱层析，本发明的方法仅以酒水溶液自一红曲发酵产品的中萃取出含有红曲素(Monascin)及红曲黄素(Ankaflavin)的沉淀物，因此具备了萃取速度快以及减少使用有机溶剂的优点。此外，经由本发明的方法所获得的沉淀物，其不需要经过减压浓缩步骤便自然地含有萃取回收率高达97.35％的红曲素(Monascin)以及萃取回收率高达95.16％的红曲黄素(Ankaflavin)。

　　图1A与图1B为本发明所提出的一种纯物质萃取方法的第一实施例的步骤流程图；

　　图2A与图2B为本发明所提出的一种纯物质萃取方法的第二实施例的步骤流程图。

　　为了能够更清楚地描述本发明所提出的一种新颖纯物质萃取方法，以下将配合图式，详尽说明本发明的较佳实施例。

　　请参阅图1A与图1B，为本发明所提出的一种纯物质萃取方法的第一实施例的步骤流程图。如图1A与图1B所示，本发明的纯物质萃取方法的第一实施例包括以下步骤：

　　步骤(S01):备好60克的发酵红曲米并以300毫升的乙醇(95％)作为提取液，接着于60℃下对该发酵红曲米进行萃取，历时2小时；

　　步骤(S02):收集前述步骤(S01)的一第一萃取液并过滤，进而得到一第一过滤萃取液以及经过一次萃取的该发酵红曲米；

　　步骤(S03):以300毫升的乙醇(95％)为提取液，然后于60℃下对该发酵红曲米进行再次萃取，历时2小时；

　　步骤(S04):收集前述步骤(S03)的一第二萃取液并过滤，进而得到一第二过滤萃取液；

　　步骤(S05):混合该第一过滤萃取液与该第二过滤萃取液，得到一混合萃取液，并将该混合萃取液浓缩至浓稠状；

　　步骤(S06):加入10mL的乙醇(95％)于该混合萃取液中，以获得一样品溶液；

　　步骤(S07):于60℃的水浴(water bath)下搅拌该样品溶液5分钟，接着加入10mL的水于该样品溶液中，然后再次搅拌该样品溶液5分钟；

　　步骤(S08):以转速2000rpm/min对前述步骤(S07)所得的该样品溶液进行10分钟的离心步骤，接着收集一沉淀物。

　　于此，必须补充说明的是，虽然步骤(S01)中以乙醇对发酵红曲米进行萃取，然而，由于本发明的纯物质萃取方法用以自红曲发酵产品中萃取出纯物质，因此步骤(S01)中也可以使用乙醇对红曲山药进行萃取。当然，虽然步骤(S01)说明所秤取的发酵红曲米为60克，亦并非以此为限。并且，本发明也没有特别限制步骤(S01)与步骤(S03)所使用的乙醇提取液的体积必须为300毫升，实务操作中该提取液的体积介于250毫升至320毫升之间即可。另外，提取温度(30℃)可视情况调整至50℃至65℃之间，且60℃的水浴温度也可视情况调整至55℃至75℃之间。

　　必须特别强调的是，步骤(S05)所述的乙醇溶剂的体积(即，10毫升)以及步骤(S06)所述的水的体积(即，10毫升)是必须适当调配的，该两者的大小将影响沉淀物占样品溶液的一重量百分比以及红曲黄色素(红曲黄素ankaflavin与红曲素monascin)的萃取回收率。下列表一记载了不同的乙醇溶剂体积以及水体积对于沉淀物重量与红曲黄色素萃取回收率的影响。

　　由表一，可以发现的是，将步骤(S05)所述的乙醇体积以及步骤(S06)所述的水体积适当调配成8毫升以及12毫升，则所得到的沉淀物显示出最大的重量百分比(43.24％)；同时，红曲黄色素(红曲黄素ankaflavin与红曲素monascin)的萃取回收率亦达到最高的99.8％与99.79％。

　　前述第一实施例的萃取方法属于实验室层级的萃取方法，其实际上仅以酒水溶液作为提取液便能够自红曲发酵产品的二次代谢产物的中萃取出红曲黄素(ankaflavin)与红曲素(monascin)。进一步地，以下将继续说明本发明所提出的纯物质萃取方法的第二实施例，属于量产层级的萃取方法。请参阅图2A与图2B，为本发明所提出的一种纯物质萃取方法的第二实施例的步骤流程图。如图2A与图2B所示，本发明的纯物质萃取方法的第二实施例包括以下步骤：

　　步骤(S01’):备好20公斤的发酵红曲米并以60公升的乙醇(95％)作为提取液，接着于60℃下对该发酵红曲米进行萃取，历时2小时；

　　步骤(S02’):收集前述步骤(S01’)的一第一萃取液，并过滤，进而得到一第一过滤萃取液以及经过一次萃取的该发酵红曲米；

　　步骤(S03’):以60公升的乙醇(95％)为提取液，然后于60℃下对该发酵红曲米进行再次萃取，历时2小时；

　　步骤(S04’):收集前述步骤(S03’)的一第二萃取液，并过滤，进而得到一第二过滤萃取液；

　　步骤(S05’):混合该第一过滤萃取液与该第二过滤萃取液，得到一混合萃 取液；

　　步骤(S06’):将该混合萃取液浓缩至4公升，然后4公升的水加入该混合萃取液中，以获得一第一样品溶液；

　　步骤(S07’):以转速2000rpm/min对前述步骤(S06’)所得的该第一样品溶液进行10分钟的离心步骤，接着收集一第一沉淀物；

　　步骤(S08’):将该第一沉淀物溶于1.5公升的乙醇(95％)中，以获得一第二样品溶液；

　　步骤(S09’):于60℃的水浴下搅拌该第二样品溶液15分钟，接着加入2公升的水于该第二样品溶液中，之后再搅拌该第二样品溶液5分钟；

　　步骤(S10’):以转速2000rpm/min对前述步骤(S09’)所得的该第二样品溶液进行10分钟的离心步骤，接着收集一第二沉淀物；其中，该第二沉淀物中包含萃取回收率达98.59％的红曲素以及萃取回收率达98.51％的红曲黄素。

　　为了证实上述步骤(S10’)所得的第二沉淀物的确含有红曲黄素与红曲素，本发明进一步利用下列的纯物质分离步骤以分离第二沉淀物中的红曲黄素与红曲素。

　　步骤(S11’):备好干燥的第二沉淀物共662克与冲提液，接着利用中压液相层析(Medium Pressure Liquid Chromatography,MPLC)对该第二沉淀物进行纯化；其中，所述冲提溶剂为5种，分别为正己烷/乙酸乙酯＝1/0、正己烷/乙酸乙酯＝9:1、正己烷/乙酸乙酯＝8:2、正己烷/乙酸乙酯＝7:3、正己烷/乙酸乙酯＝6:4(v/v,体积比)；

　　步骤(S12’):自前述步骤(S11’)所获得的5个分层中取出黄色素分层；

　　如此，上述步骤(S11’)～步骤(S14’)证实由步骤(S10’)所得的第二沉淀物的中的确含有高纯度的红曲黄素与红曲素；并且，所述第二沉淀物经过中压液相层析之后，其经由层析所得的黄色素分层含有至少57.5％的红曲黄素与红曲 素。可预见地，若以制备型HPLC设备分离黄色素分层之中的红曲黄素与红曲素，则每次分离(每20分钟)可获得22.5毫克的红曲素以及16.83毫克的红曲黄素。更进一步地，若以工业型HPLC设备分离黄色素分层之中的红曲黄素与红曲素，则可大量生产的红曲黄素与红曲素。

　　如此，上述说明完整、且清楚地说明本发明的纯物质萃取方法的详细步骤与技术特征；并且，经由上述可以得知本发明的纯物质萃取方法具有以下的优点：

　　(1)不同于现有的纯物质萃取方法，本发明的新颖纯物质萃取方法以酒水溶液取代现有的萃取液以及管柱层析，因此具备了萃取速度快以及减少使用有机溶剂的优点。

　　(2)此外，经由本发明的方法所获得的沉淀物，其不需要经过减压浓缩步骤便自然地含有萃取回收率高达97.35％的红曲素以及萃取回收率高达95.16％的红曲黄素。

　　(3)再者，不同于现有的高速逆流层析法，经由本发明的方法所获得的沉淀物，只需要通过制备型HPLC设备便能够于每次的分离步骤中(每20分钟)获得22.5毫克的红曲素以及16.83毫克的红曲黄素；明显地，本发明的方法显示出低成本、高量产效率的优势。

　　当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。